محیط زیست

مشاهده باکتری ها و انجام رنگ آمیزی ساده

برای مشاهده میکروارگانیسم ها به دو روش عمل می­شود:

1-  روش قطره معلق: با این روش هم یوکاریوت ها و هم پروکاریوتها را می­توان مطالعه کرد و هدف آن مشاهده وجود یا عدم وجود حرکت در میکروارگانیسم است. این روش برای باکتری ها مشکل اما مخمر را به راحتی می­توان دید.

2-  تثبیت باکتری: چنانچه هدف مطالعه شکل باکتری و یا واکنش نسبت به رنگ آمیزی گرم، وجود یا عدم وجود کپسول، تاژک، اسپور و نظایر آن باشد باید ابتدا باکتری را روی لام تمیز تثبیت کرد. برای تثبیت باکتری ابتدا یک لام تمیز انتخاب کرده، اگر کثیف بود از روی شعله عبور داده تا چربی حذف و استریل شود. یک قطره آب مقطر یا سرم فیزیولوژی به وسیله آنس استریل روی لام منتقل می­کنیم، مجدداً آنس را استریل کرده به تجمع باکتری تماس داده و به روی آب مقطر منتقل می­کنیم. همزده تا شیرابه سلولی ایجاد شده و به اندازه 1 سانتی­متر پخش کرده و اجازه می­دهیم لام در جریان هوا خشک شود. اگر ضخامت گسترش زیاد باشد مقدار زیادی باکتری روی هم قرار گرفته و مانع از عبور نور می­شود. در مرحله بعد گسترش تهیه شده را تثبیت می­کنیم. برای تثبیت، لام را از جهت حاوی گسترش 3 بار از داخل شعله عبور می­دهیم با این کار باکتری گشته شده پروتئین ها منعقد و به لام می­چسبد و امکان نفوذ رنگ به اجزاء سیتوپلاسمی فراهم می­گردد.

هدف از رنگ آمیزی باکتری ها

برای مشاهده بهتر و آسان تر باکتری ها آنها را رنگ می­کنند.چراکه باکتری های رنگ نشده در زیر میکروسکوپ شفاف و بی­رنگ هستند. بنابراین برای مشاهده آسان تر، جداسازی و شناسایی میکروبها اغلب از رنگ آمیزی استفاده می­شود.

رنگ های مورد استفاده در رنگ آمیزی باکتری ها اکثراً از موادی که در قطران زغال سنگ موجود است ساخته می­شود.این رنگ ها به دو گروه اسیدی و قلیایی تقسیم می­شوند.

رنگ اسیدی: فوشین که نسبت به بخش های بازی باکتری(مثل اجزاء سیتوپلاسم) میل ترکیبی دارد.

رنگ قلیایی: کریستال ویوله، آبی متیلن و سافرانین نسبت به بخش های اسیدی تمایل شدیدی دارند. دیواره دارای اسید تیکوئیک است که در محیط مایعی که باکتری قرار می­گیرد یونیزه شده و بار منفی می­گیرد. ماده رنگی در تجارت به صورت نمک ساخته می­شود که در داخل آب یونیزه شده و سپس جذب بار مخالف خود در سلول می­شود.

MBcl              MB⁺ +cl^-

در ضمن عوامل فیزیکی نیز در خاصیت رنگ پذیری باکتری ها است به طور مثال فشار اسمزی و خاصیت چسبندگی در غلظت های بالا و به دام افتادن مولکول های رنگ در حفره های پلی­مری و ماکروملکولی ها، از جمله عوامل فیزیکی هستند.

انواع رنگ آمیزی

1-  رنگ آمیزی ساده: فقط از یک محلول برای رنگ آمیزی باکتری ها استفاده می­شود.بدین وسیله می­توان به شکل باکتری ها پی­برد. در رنگ آمیزی ساده کلیه سلول های موجود در گسترش به یک رنگ دیده می­شوند(مانند رنگ امیزی با آبی متیل یا سافرانین).

2-   رنگ آمیزی مرکب: از چند محلول رنگی برای رنگ آمیزی باکتری و قسمت های مختلف استفاده میگردد.

3-  رنگ آمیزی منفی: از رنگ هایی مثل نیگروزین و مرکب چینی استفاده می­شود. به علت اینکه این رنگ ها نمی­توانند به داخل باکتری نفوذ نمایند، باکتری ها بی­رنگ و زمینه لام تیره دیده می­شود.

4-  رنگ آمیزی افتراقی(انتخابی): نوعی رنگ آمیزی است که باکتری های مختلف در برابر آن واکنش متفاوت نشان می­دهند و از این جهت می­توان آنها را برای تشخیص باکتری ها یا قسمت های مختلف باکتری بکار برد.

انجام آزمایش:

الف) به وسیله لوپی استریل مقداری ماست برداشته و بر روی لام تمیز منتقل کرده و گسترشی از آن تهیه می­کنیم. پس از اضافه کردن یک قطره روغن سدر یا ایمرسیون زیر میکروسکوپ سلول های زنده و بی رنگ را مشاهده می­کنیم.

ب)از نمونه میکروبی در دسترس با آنس استریل گسترش تهیه کرده و پس از تثبیت باکتری روی لام، به مدت 1 دقیقه به وسیله محلول رنگی گسترش را می­پوشانیم و سپس زیر جریان ملایم آب مقطر لام را شسته و پس از خشک شدن در جریان هوا با اضافه کردن یک قطره روغن زیر میکروسکوپ مشاهده می­کنیم.